Images de microscopie à fluorescence à couche mince plus profondes dans les tissus

Une technique récemment mise au point, la microscopie à fluorescence sur feuille de lumière, a permis de nombreuses découvertes biologiques en permettant aux chercheurs de créer des images 3D de tissus, même d'embryons d'animaux vivants, à l'aide d'étiquettes fluorescentes. À présent, les chercheurs signalent la possibilité d’augmenter la profondeur d’imagerie de la microscopie à fluorescence à feuilles lumineuses grâce à l’utilisation d’un phénomène optique appelé absorption à trois photons.

Dans la revue Optics Letters de la Optical Society (OSA), les chercheurs expliquent en détail comment l’absorption à trois photons peut être utilisée avec la microscopie à fluorescence à feuilles lumineuses pour réaliser des images plus profondes dans les tissus. À titre de démonstration, ils ont utilisé la technique combinée pour produire des images claires dans une boule de cellules en culture, appelée sphéroïde, d'environ 450 microns de diamètre.

"Cette démonstration est très importante car elle répond à un besoin non satisfait de meilleure imagerie en profondeur, ce qui pourrait aider les scientifiques à obtenir de meilleures données sur les processus biologiques", a déclaré le chef de l'équipe de recherche Kishan Dholakia de l'Université de St. Andrews au Royaume-Uni. "Cette approche pourrait être particulièrement utile pour les études de neuroscience et de biologie du développement et pourrait trouver une application dans l'imagerie de plusieurs échantillons de manière automatisée pour la découverte de médicaments."

La lumière nécessaire pour imager les marqueurs fluorescents peut être dommageable, voire mortelle, pour des échantillons biologiques délicats tels que des tissus cérébraux ou des embryons d'animaux utilisés pour étudier le développement et les processus pathologiques. La microscopie par fluorescence de feuilles lumineuses permet une imagerie rapide à haute résolution avec peu de dommages optiques, car elle éclaire un échantillon avec une fine feuille de lumière. les autres parties de l'échantillon ne reçoivent aucune exposition inutile à la lumière.

"Nous prévoyons que la microscopie à fluorescence à trois photons en feuille de fluorescence aura un impact important sur l'imagerie du cerveau chez des rongeurs tels que les souris et les rats, où elle pourrait être utilisée pour capturer des images à très grand champ avec une résolution subcellulaire", déclare le premier auteur du journal. Adrià Escobet-Montalbán.

Imagerie plus profonde

Les chercheurs ont voulu comparer la microscopie à fluorescence à trois photons par feuille de fluorescence à l'absorption à deux photons précédemment utilisée. En absorption multiphotonique, le marqueur fluorescent émet de la lumière après avoir absorbé ou excité deux ou trois photons au lieu du photon utilisé pour produire la fluorescence traditionnelle.

L'absorption multiphoton réduit la lumière floue et minimise la lumière qui pourrait nuire à l'échantillon car il utilise des longueurs d'onde plus longues, moins dispersées par les tissus, et en confinant la lumière d'excitation à un petit volume. Lorsque trois photons sont utilisés pour produire une fluorescence plutôt que deux, ces avantages sont amplifiés.

Pour démontrer leur nouvelle technique, les chercheurs ont utilisé une configuration optique standard pour la microscopie par fluorescence de feuilles lumineuses avec un laser pulsé traditionnellement utilisé pour l'excitation à deux photons. Bien que ce laser ne soit pas le plus approprié pour créer une excitation efficace à trois photons, il était idéal pour comparer l’excitation à deux photons et à trois photons.

L'équipe de recherche a imaginé des sphéroïdes de cellules rénales embryonnaires humaines en utilisant une excitation à deux et trois photons. Près de la surface du sphéroïde, les deux modalités d'imagerie ont fonctionné de manière similaire. Cependant, du côté éloigné du sphéroïde, la qualité de l'image pour la microscopie à fluorescence à trois photons en feuille de lumière préservait le contraste de l'image alors que la qualité de l'image à deux photons diminuait considérablement.

Optimiser la technique

Pour améliorer encore l’imagerie en profondeur et le champ de vision, les chercheurs ont tenté de modifier le profil d’intensité de la lumière du laser en un faisceau de Bessel, doté d’un noyau central brillant entouré d’anneaux concentriques plutôt un pointeur laser.

"Les faisceaux de Bessel peuvent être utilisés en mode feuille à deux photons mais peuvent générer des artefacts potentiels en raison de leurs anneaux concentriques", explique le co-auteur, Federico Gasparoli. "Pour la première fois, nous montrons numériquement et expérimentalement que ces problèmes sont éliminés par microscopie à fluorescence à trois photons et que le faisceau va encore plus loin, ce qui rend cette approche très attrayante."

Ensuite, les chercheurs envisagent d’améliorer la technique en utilisant des systèmes laser à longueurs d’onde plus longues spécialement conçues pour l’absorption à trois photons. Cela devrait permettre une imagerie à une profondeur accrue. En parallèle, les chercheurs travaillent à développer des moyens de détecter la lumière émise par les étiquettes fluorescentes au fond des échantillons.